miRNA測序

microRNA(miRNA) 是一種大小約21—23個堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發夾結構的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經過Dicer酶加工后生成，不同于 siRNA（雙鏈）但是和siRNA密切相關。microRNA通過和靶基因mRNA堿基配對引導沉默復合體（RISC）降解mRNA或抑制mRNA的翻 譯，從而在轉錄后水平調控蛋白表達（最新發現miRNA也能在轉錄水平調控基因表達）。miRNA在物種進化中相當保守，在動物、植物和真菌等中發現的 miRNA表達均有嚴格的組織特異性和時序性。miRNA在細胞生長和發育過程中起多種作用，包括調控發育、分化、凋亡和增殖等。

目前研究miRNA的方法主要是realtime-PCR、生物芯片技術以及第二代測序技術?；诘诙鷾y序技術的miRNA測序，可以一次獲得數百萬條 miRNA序列，能夠快速鑒定出不同組織、不同發育階段、不同疾病狀態下已知和未知的miRNA及其表達差異，為研究miRNA對細胞進程的作用及其生物 學影響提供了有力工具。

已經被鑒定的miRNAs據推測大都是由具有發夾結構，約70個堿基大小形成發夾結構的單鏈RNA前體經過Dicer酶加工后生成的，有5’端磷酸基和3’羥基，大小約21—25nt的小分子RNA片斷，定位于RNA前體的3’端或者5’端。

3個研究小組分別從線蟲、果蠅和Hela細胞中鑒定的100個新miRNAs中，有15%跨越線蟲、果蠅和哺乳動物基因組具有高度的保守性（只有有1—2個堿基的區別）。Lau 和Bartel 實驗室的同事更加認為：所有的miRNAs可能在其他物種中具有直向同源物（Ortholog，指那些起源于同一祖先，在不同生物體中行使同一功能的基因群就可比作為一個門類，這些類似的基因被稱為“直向同源物”）。

Bantam 最早被認為是果蠅中參與細胞增殖的一個基因位點。已知幾個包含增強子的轉座子插入跨越這個位點的一段12.3kb區域會導致果蠅的眼和翅重復生長，而由轉座子介導的一段跨越該位點的23kb片斷缺失則導致突變果蠅個體小于野生型果蠅。Cohen和同事用一段3.85kb的片斷導入21kb片斷缺失的果蠅中使其恢復原來的大小。但是奇怪的是表達這個3.85kb片斷中的EST卻沒有同樣的效果。Cohen將這個片斷和瘧蚊Anopheles gambiae的同源序列進行比較，發現一段90bp的高度保守區，經過RNA folding program (mfold)發現這個保守序列可以形成發夾結構，使得這個區段很象是一個miRNA的前體。這個結果經過Northern blot證實突變果蠅的幼體缺少一個21bp的bantam miRNA ，用這個90bp的mRNA前體經過一系列的“功能缺失”—“功能恢復”實驗，證實 bantam miRNA在細胞增殖中的作用。研究人員用計算機程序檢索在hid mRNA的3’非編碼區找到了bantam的3個潛在的結合位點（ hid是果蠅中一個誘導凋亡的基因），并證實 bantam miRNA抑制hid 的翻譯而非轉錄。

miRNAs的表達方式各不相同。部分線蟲和果蠅的miRNA在各個發育階段的全部細胞中都有表達，而其他的miRNA則依據某種更為嚴謹的位相和時相的表達模式（a more restricted spatial and temporal expression pattern）——在不同組織、不同發育階段中miRNA的水平有顯著差異。

科學家開始認識到這些普遍存在的小分子在真核基因表達調控中有著廣泛的作用。在線蟲，果蠅，小鼠和人等物種中已經發現的數百個miRNAs中的多數具有和其他參與調控基因表達的分子一樣的特征——在不同組織、不同發育階段中miRNA的水平有顯著差異，這種miRNAs表達模式具有分化的位相性和時序性（ differential spatial and temporal expression patterns），提示miRNAs有可能作為參與調控基因表達的分子，因而具有重要意義。

第一個被確認的miRNA——在線蟲中首次發現的lin-4和let-7，可以通過部分互補結合到目的mRNA靶的3’非編碼區(3’UTRs)，以一種未知方式誘發蛋白質翻譯抑制，進而抑制蛋白質合成，通過調控一組關鍵mRNAs的翻譯從而調控線蟲發育進程(reviewed in Pasquinelli 2002)。

bantam miRNA是第一個被發現有原癌基因作用的miRNA。除了lin-4、let-7，已知還有一些miRNAs可能參與在細胞分化和組織發育過程中起重要作用的基因的轉錄后調控，例如mir-14、mir-23 等。

在植物miRNAs的研究中有兩條線索提示miRNAs可能參與植物的發育過程。一是在carpel factory (car) 突變株中3個miRNAs的表達水平顯著下降。CARPEL FACTORY 是一個類似Dicer的酶，參與植物的發育，其缺失突變株表現為胚胎和葉片發育的缺陷。實驗結果提示這種缺陷是由于缺少miRNAs加工而造成的。多數的植物miRNAs在某些特定組織中高水平表達也提示他們可能參與了植物組織的發育。

對一部分miRNAs的研究分析提示：miRNAs參與生命過程中一系列的重要進程，包括早期發育(Reinhart 2000)，細胞增殖，細胞凋亡，細胞死亡(Brennecke 2003），脂肪代謝（Xu 2003)和細胞分化(Kawasaki 2003)。此外，一個研究表明，2個miRNAs水平的下降和慢性淋巴細胞白血病之間的顯著相關，提示miRNAs和癌癥之間可能有潛在的關系(Calin 2002)。

由于miRNAs存在的廣泛性和多樣性，提示miRNAs可能有非常廣泛多樣的生物功能。盡管對miRNA的研究還處于初級階段，據推測miRNAs在高級真核生物體內對基因表達的調控作用可能和轉錄因子一樣重要。有一種看法是：miRNAs可能代表在一個新發現的層次上的基因表達調控方式。

然而，大多數miRNAs的功能仍然是個謎。

MicroRNA的過表達

MicroRNA存在多種形式，最原始的是pri-miRNA ，長度大約為300-1000個堿基pri-miRNA經過一次加工后，成為pre-miRNA 即microRNA前體，長度大約為70-90個堿基；pre-miRNA再經過Dicer酶酶切后，成為長約20-24nt的成熟miRNA 。

實際研究中，pre-miRNA應用最早，也最廣泛，目前很多商業化的MicroRNA庫都是pre-miRNA形式的。近幾年來，研究發現microRNA的雙臂對成熟miRNA的形成有著十分重要的作用，所以天然的pri-miRNA形式越來越多地被研究者采用。

MicroRNA的下調

化學合成的miRNA inhibitors ，用于下調目的細胞中的miRNA ，以實現loss-of function研究。

如果您需要進行長期、穩定的miRNA下調，則可以選用載體形式的miRNA inhibitor。其轉染效率高，下調效果好，可以實現對目的miRNA的長期、穩定的下調。

載體形式的miRNA inhibitor，采用的方法如miRNA sponge法，這也是目前SCI文獻中用的較多的一種方法。

microRNA-RISC對靶基因mRNA的作用一直主要取決于它與靶基因轉錄體序列互補的程度，有三種方式。

第一種是切斷靶基因的mRNA分子——miRNA與靶基因完全互補結合，作用方式和功能與siRNA非常相似，最后切割靶mRNA。在植物中，大部分miRNA都以這種方式，靶基因mRNA斷裂后，無poly(A)的分子的3‘ 端加上多個U并很快降解，含poly(A)的分子能穩定存在一段時間（如擬南芥miR-171）。在植物中目前有一個miRNA和3個潛在的目標靶基因完全互補（這些scarecrow 基因編碼潛在的轉錄因子），盡管還不清楚這些基因是否就是miRNA的目標靶，這仍是第一次發現miRNA 和其潛在的目標靶完全互補，也提示miRNA可能包含和siRNA類似的作用方式。

第二種是抑制靶基因的翻譯——作用時與靶基因不完全互補結合，進而阻遏翻譯而不影響mRNA的穩定性，這種miRNA是目前發現最多的種類（如線蟲lin-4）。而在植物中極少數的miRNA通過此方式來抑制靶基因。

第三種是結合抑制——具有以上兩種作用模式：當與靶基因互補結合時，直接靶向切割mRNA；當與靶基因不完全結合時，起調節基因表達的作用。

多個研究小組采用生物化學結合是生物信息學的方法開展對miRNAs的研究工作。由于據推測都是由Dicer酶降解RNA得到的，21—23個堿基大小、有5’端磷酸基和3’羥基的RNA片斷，有的實驗室采用改良的定向克隆方法來篩選具有相同特征的小分子——篩選一定大小的RNA分子，連接到3’和5’的適配子（adapters），逆轉錄并通過PCR擴增、亞克隆并測序。miRNA前體在基因組上的定位和聚類是通過向基因組數據庫查詢進行。這個方法有助于判斷miRNAs是否是mRNAs、tRNAs、rRNAs等分子的降解產物。

有的實驗室通過一種RNA folding program ’mfold’ 來判斷C. elegans 和C. briggsae 之間的高度保守區域是否含有潛在的miRNA前體，然后用Northern Blots的方法來確定這些miRNAs是否真的表達了。

盡管有數百個miRNAs通過生化或者是生物信息學的方法被鑒別出來，已經鑒別出來的miRNAs只不過是滄海一粟，由于很多已經鑒別出來的miRNAs是從單個克隆中鑒別出來的，所以可以假設還有很多miRNAs在分離和鑒定過程中被“漏掉”了，測序工作還遠遠不夠。

miRNA在細胞分化，生物發育及疾病發生發展過程中發揮巨大作用，越來越多的引起研究人員的關注。隨著對于miRNA作用機理的進一步的深入研究，以及利用最新的例如miRNA芯片等高通量的技術手段對于miRNA和疾病之間的關系進行研究，將會使人們對于高等真核生物基因表達調控的網絡理解提高到一個新的水平。這也將使miRNA可能成為疾病診斷的新的生物學標記，還可能使得這一分子成為藥靶，或是模擬這一分子進行新藥研發，這將可能會給人類疾病的治療提供一種新的手段。