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      1. 021-67658806

        技術專題

        非編碼RNA之環狀RNA最新研究進展

        環狀RNA(circRNA)是一類不具有5' 末端帽子和3' 末端poly(A)尾巴、并以共價鍵形成環形結構的非編碼RNA分子。

        環狀RNA是區別于傳統線性RNA的一類新型RNA,具有閉合環狀結構,大量存在于真核轉錄組中。大部分的環狀RNA是由外顯子序列構成,在不同的物種中具有保守性,同時存在組織及不同發育階段的表達特異性。大部分環狀RNA在細胞漿中富集,其豐度有時甚至比相應的線性mRNA高10余倍,這可能是由于環狀RNA比線性RNA更穩定造成的。核酸酶往往通過識別線性RNA分子末端發揮作用,環狀RNA是一個閉合結構,對核酸酶具有高耐受性,因此比線性RNA更為穩定,這使得環狀RNA在作為新型臨床診斷標記物的開發應用上具有明顯優勢。此外,近期研究顯示,環狀RNA在不同物種中起到miRNA海綿的作用,稱之為競爭性內源RNA(ceRNA),能競爭性結合miRNA,從而調控靶基因的表達。這表明環狀RNA可能通過競爭性結合疾病相關的miRNA在疾病調控中發揮著非常重要的作用。

        1.Science:重磅!揭示環狀RNA與大腦功能存在關聯
        doi:10.1126/science.aam8526

        環狀RNA能夠影響正常的大腦功能,圖片來自德國馬克斯-德爾布呂克分子醫學中心環狀RNA生物學培訓網絡。


        盡管上百種環狀RNA(circular RNA, circRNA)在哺乳動物大腦中大量存在,但是一個重要的問題仍未解決:它們實際上發揮著什么作用?在一項新的研究中,來自德國馬克斯-德爾布呂克分子醫學中心的Nikolaus Rajewsky和他的團隊首次將一種circRNA與大腦功能關聯在一起。相關研究結果于2017年8月10日在線發表在Science期刊上,論文標題為“Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulation and affects brain function”。

        Rajewsky團隊提出circRNA至少有時發揮著基因調節的作用。作為一種較大的單鏈環狀RNA,Cdr1as有大約1500個核苷酸,可能發揮著像海綿那樣吸收微RNA(microRNA, miRNA)的作用。比如,它為一種被稱作miR-7的microRNA提供70多個結合位點。microRNA是較短的RNA分子,通常結合到信使RNA(mRNA)的互補序列上,因而控制著細胞產生的特定蛋白數量。

        在當前的這項研究中,Rajewsky團隊與馬克斯-德爾布呂克分子醫學中心的Carmen Birchmeier實驗室合作重新研究了Cdr1as。論文共同第一作者Monika Piwecka說,“這種特定的circRNA能夠在興奮性神經元中但不在神經膠質細胞中發現。在小鼠和人類的大腦組織中,存在兩種結合到它上的microRNA:miR-7和miR-671?!?br style="margin: 0px; padding: 0px; color: rgb(37, 37, 37); font-family: 微軟雅黑, "microsoft yahei", Arial, sans-serif; font-size: 16px; background-color: rgb(255, 255, 255);">
        接下來,Rajewsky和他的合作者們利用基因組編輯技術CRISPR/Cas9選擇性地剔除小鼠中的一種環狀RNA,即Cdr1as。在這些小鼠中,大多數microRNA的表達在4個研究的大腦區域中未被干擾。然而,miR-7下調表達,miR-671上調表達。這些變化是轉錄后發生的,這就與Cdr1as通常與細胞質中的這些microRNA相互作用的觀點相一致。

        2.Nat Biotechnol:環狀RNA的檢測與研究
        doi:10.1038/nbt.2890

        環形RNA轉錄早在上世紀90年代就被發現了,但是限于當時的技術和知識水平,科研工作者并不能對其進行充分而詳實的研究。

        最近發表在《自然?生物技術》上面的文章為我們提供了一個全新的對環形RNA進行研究的方法與認識。最近的研究已經顯示,在哺乳動物細胞中存在多種環形DNA,起作用多為對miRNA行使功能進行調控。盡管,目前只有少部分的環形DNA被發現,其中的大部分還是由于RNA的錯誤剪接產生的,但是,通過這個新方法可以更有效的細胞內的環形DNA進行捕獲與檢測。同時由于環形RNA在生物體內的重要作用,因此,在可期的未來,環形RNA的研究將會變得非常重要。

        3.農科院破譯環狀RNA調控豬產肉性狀分子機制
        doi:10.1093/dnares/dsx022

        近日,中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所“豬基因工程與種質創新團隊”和農業基因組研究所“豬基因組設計育種創新團隊”合作,歷時3年,開發出環狀RNA研究平臺,繪制豬環狀RNA時空圖譜,破譯環狀RNA對豬產肉性狀形成調控機制,并構建首個農業動物的環狀RNA數據庫。該成果最近發表在國際基因組領域知名刊物《DNA research》。唐中林研究員為該文共同通訊作者,梁國明博士后為第一作者。 

        研究者從豬脂肪、心肌和肝等9種不同組織以及三個發育階段的骨骼肌中,系統鑒定5934個環狀RNA,分子特征分析表明豬環狀RNA表達具有高度的時空特異性,與小鼠和人等物種具有較強的保守性;30%以上的環狀RNA作為miRNA的sponges對基因表達發揮重要調控作用;發現數百條骨骼肌中特異性豐富表達以及產肉性狀相關環狀RNA分子。進一步的功能分析表明:在出生后0-30天,circRNA主要調控骨骼肌的生長發育和肌纖維類型轉換;30-240天時,circRNA主要調控骨骼肌糖代謝和鈣離子信號。最后,研究人員構建了circRNA-miRNA-mRNA多維調控網絡和環狀RNA數據庫。據悉,這是農業動物首張環狀RNA的時空圖譜和首個數據庫。

        4.Cancer Res:科學家發現一種促進結腸癌生長和轉移的環狀RNA
        doi:10.1158/0008-5472.CAN-16-1883

        最近來自臺灣國立成功大學的研究人員在國際學術期刊Cancer Research上發表了一項最新研究進展,他們在結直腸癌中發現一種新的環狀RNA分子,并證明該分子在癌癥進展和侵襲轉移過程中發揮癌基因的功能。該研究為了解環狀RNA在癌癥中的作用以及尋找新的癌癥治療方向提供了的信息。

        在這項研究中,研究人員對結直腸癌疾病中一類新的環狀RNA——circCCDC66的功能性作用進行了描述。他們對配對的正常和腫瘤結腸組織樣本進行了RNA測序,在測序數據中發現了大量在癌細胞中特異性升高的環狀RNA,其中一些得到了實時定量PCR(RT-PCR)的驗證。

        研究結果表明circCCDC66在息肉和結腸癌中存在表達升高,并且還與不良預后相關。通過在結直腸癌細胞系中進行功能獲得性研究和功能缺失性研究,研究人員證明circCCDC66能夠控制多個生理過程,其中包括細胞增殖,遷移,侵襲和非貼附性生長。更深度的研究表明circCCDC66通過調節一系列癌基因來發揮它的功能,并且在異種移植腫瘤模型和原位模型中敲低circCCDC66的表達都能夠抑制腫瘤生長和癌癥侵襲。

        5.circRNADb:首個匯總編碼蛋白環狀RNA的數據庫
        doi:10.1038/srep34985

        2016年10月11日,Nature出版集團子刊Scientific Reports在線發表了南京醫科大學Li Yan團隊的一項重要環狀RNA研究成果,介紹開發了首個匯總可編碼蛋白的環狀RNA的數據庫:circRNADb(Chen et al., 2016)。(數據庫網址:http://reprod.njmu.edu.cn/circrnadb)

        文中作者通過匯總整理,共收集了32914條人類外顯子環狀RNA記錄,每條記錄都包括基因組位置信息,RNA編輯情況,所對應的基因組序列,IRES序列元件,預測的ORF以及相關的參考文獻。作者發現了有16328條環狀RNA包含了編碼超過100個氨基酸的ORF,其中7170種環狀RNA存在IRES序列元件,基本符合翻譯蛋白的特征(Chen et al., 2016)。

        這一數據庫提供了一個非常有用的環狀RNA研究工具,但本文所引用的文獻還沒有完全涵蓋目前所有的環狀RNA研究報道,文中也人為設置了大于300bp(100個氨基酸)作為ORF預測的標準,一定程度限制了該數據庫的全面性。相信作者會在后續的工作中逐步完善,使得該數據庫能更好的服務廣大同行。大家在面對具體的研究對象時也不妨參考一下本文作者的思路,預測分析一下所感興趣的環狀RNA是否攜帶IRES和ORF。

        備注:IRES是internal ribosome entry site的簡寫,是一種具備募集核糖體并實現核糖體組裝和后續閱讀框翻譯蛋白的RNA調控元件。ORF是Open Reading fr ame的簡寫,指的是對應于蛋白氨基酸序列的密碼子序列,從ATG其實密碼子開始,到終止密碼子結束。值得一提的是,不是每個ORF都有機會翻譯出蛋白質的,還需要有上游的核糖體募集組裝以及一些翻譯調控元件的存在才可以,IRES就是一類特殊的翻譯調控元件。

        6.Nature:震驚遺傳界的環狀RNA
        doi:10.1038/nature11928; doi:10.1038/nature11993

        在最新一期(2013年2月27日)《自然》(Nature)雜志上,兩篇重要的研究論文揭示出一些環狀RNA充當分子“海綿”,結合并封閉了稱作microRNAs的微小基因調控子。此外,研究人員推測環狀RNAs還具有許多其他的功能。其中一篇Nature文章的主要作者、德國Max Delbrück分子醫學中心系統生物學家Nikolaus Rajewsky說,這些分子構成了一個“隱秘的未知RNAs平行宇宙”。 

        這一發現再次提醒人們:RNA并不僅僅是DNA與編碼蛋白之間的一個平凡信使。在過去的20年里,研究人員發現了大量的非常規RNA。一些長度意想不到的短,一些則長到令人感到驚訝,而另一些則顛覆常規具有阻止其他RNA鏈翻譯形成蛋白質的功能。幾乎所有的RNA都是線性的,為數不多的關于植物和動物中的環狀RNAs的記述,也被當做遺傳意外或實驗人為因素而遭到忽視。

        這兩篇論文都將焦點放在了由大約1500個核苷酸構成的一個環狀大RNA上,它表達于小鼠和人類的大腦中。研究人員發現它包含了70個miR-7的結合位點。MicroRNAs是一些通過結合和阻止mRNA翻譯阻斷基因表達的短片段RNA。一直以來人們知道,MiR-7的靶標與癌癥和帕金森氏病存在著關聯。

        Hansen研究小組發現這一環狀RNA的表達阻斷了miR-7。它使得miR-7活性受到抑制,miR-7靶基因表達增高,研究人員推測這是因為這一RNA環捕獲和失活了miR-7。Rajewsky研究小組證實,在斑馬魚中表達這一環狀RNA或敲除miR-7可以改變大腦發育。

        Rajewsky說,環狀RNAs也可能是細胞外microRNA的海綿。一些有可能具有病毒microRNAs的結合位點,從而破壞了免疫應答。Rajewsky猜測,環狀RNA可能甚至與RNA結合蛋白發揮了互作。Salzman表示同意:“它們數量如此的豐富,可能扮演了多種功能角色?!?br style="margin: 0px; padding: 0px; color: rgb(37, 37, 37); font-family: 微軟雅黑, "microsoft yahei", Arial, sans-serif; font-size: 16px; background-color: rgb(255, 255, 255);">
        7.PLoS ONE:環狀RNA比之前認為的更加普遍
        doi:10.1371/journal.pone.0030733

        在經典的基因表達模型中,由基因組所編碼的基因腳本以RNA分子的形式表達于每一個細胞中,每一個RNA分子由線性的化學"堿基"串聯組成?,F在是該對基因表達的傳統認知進行修訂的時候了,新的研究表明,在人體細胞的基因表達程序中,環形RNA分子而非線性RNA分子是一個更普遍的特征。研究結果發表于2月1日在線期刊PLoS ONE上。

        霍華德休斯醫學研究所的研究員們和斯坦福大學生物化學教授Patrick Brown開展的一項研究發現,數以百計的人類基因轉錄本似乎由一種將RNA分子剪接成環狀的非經典程序所致。對于許多基因,這些環狀RNAs組成了所鑒定的所有轉錄本的相當一大部分,表明這些環狀RNAs比之前預想的更為豐富同時可能比之前所想的更為重要。

        "這項研究表明,仍然有重要的基礎性生物學程序需要通過結合新的統計和計算方法探索發現,"研究的作者之一Juia Salzman說。"這些環狀RNAs可能代表了一種尚未被發現的生物學過程。"

        8. Cell Res:復旦大學科學家發現外泌體中也含有大量的環狀RNA 
        doi:10.1038/cr.2015.82

        近期,中國復旦大學腫瘤研究所的黃勝林和何祥火課題組首次發現了外泌體(exosomes)含有大量 circRNA,相關研究結果發表在Cell Research期刊上,論文標題為“Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis”。

        這些研究人員從MHCC-LM3肝癌細胞和來自這種肝癌細胞的外泌體中分別提取總RNA(去除核糖體RNA),進行RNA-seq分析,發現外泌體中的circRNA比產生這種外泌體的肝癌細胞中的circRNA要豐富得多。

        9. PLoS ONE:發現circRNA有望成為人血液中的一類新型的生物標志物
        doi:10.1371/journal.pone.0141214

        研究人員首先用臨床全血樣本提取了總RNA,然后消化核糖體RNA,用隨機引物進行反轉錄后進行測序建庫。通過對兩個志愿者的RNA樣本進行測序分析,鑒定到4550個和4105個特異的circRNA分子至少有2個獨立的reads。把兩個樣本的數據進行比較分析發現樣本間的circRNA表達correlation很高(R=0.8),有1265個共有circRNAs(55%)reads數超過5,有2442個共有circRNAs(39%)reads數超過2,技術重復實驗也證明檢測重復性比較高。

        為了驗證從血液檢測到的circRNAs的可靠性,研究人員將檢測到的circRNAs與ENCODE project數據庫來源的小腦,神經組織的circRNAs結果和肝組織的結果進行了比較分析。結果顯示,血液中的circRNAs比小腦和肝中的circRNAs表達更高。 

        通過對circRNAs的來源分析,研究人員發現大部分的circRNAs來源于編碼基因的外顯子區域和5'UTR區域。另外,這些來源編碼基因的circRNAs表達和對應的mRNA表達存在著顯著的相關性。 對circRNAs的剪切長度分析顯示,在血液中的circRNAs長度與在肝和小腦中檢測到的circRNAs長度一致,集中在200-800nt(median=343nt)。值得注意的是,有些基因可以產生多個circRNAs分子,其中,有23個基因每個可以產生超過10個circRNAs。

        為了驗證測序所得得circRNAs分子的可靠性,研究人員對表達高的8個circRNAs和其線性mRNA分子進行qPCR驗證,發現有7個檢測結果是一致的。研究人員對這7個circRNAs進行了深入分析:1)核酸外切酶抵抗力檢測;2)Sanger測序確認序列信息。結果顯示7個分子的驗證結果整體錯誤率很低。

        10. Sci Rep:環狀RNA在膀胱癌中發揮重要的作用
        doi:10.1038/srep30919

        2016年8月3日,中國重慶醫科大學陳俊霞教授團隊在Scientific Reports雜志在線發表了文章,發現了一種被稱作circTCF25的環狀RNA在膀胱癌中發揮重要作用,并且鑒定出它參與的信號轉導通路。

        作者們通過對4例膀胱癌樣本中分離總RNA,進行高通量篩選,找出20種環狀RNA發生最為明顯的變化。他們從中選擇6種環狀RNA,通過進一步驗證,發現circFAM169A 和circ-TRIM24在膀胱癌組織中下調最為明顯,circTCF25、circZFR 、circPTK2和circBC048201上調最為明顯。他們隨后分析通過DIANA-miRPath通路分析揭示出它參與的信號轉導通路。

        11.挑戰常規!環狀RNA也可能表達肽分子
        doi:10.1016/j.bbagrm.2016.07.009

        2016年7月19日,研究人員在Biochimica et Biophysica Acta期刊發表了關于環狀RNA表達肽分子的綜述論文,為環狀RNA功能研究提供了新思路。

        文中他們系統分析了已發表的各種環狀RNA表達肽分子的證據和線索,如1984年,H. SCHELLEKENS等就曾在Nature上發表文章報道發現丁型肝炎病毒(HDV)的環狀RNA可以表達一種長122個氨基酸的肽分子。2014年,Tauqeer Ahmad等人在PNAS期刊上的發表的一篇文章證明在水稻中造成水稻黃斑病變的擬病毒 RYMV(rice yellow mottle virus (sobemovirus))利用環化后重疊密碼子的機制讓220nt的環狀RNA表達生成16kD大小的肽分子。在哺乳動物系統以及體外實驗中也發現了一些環狀RNA可表達肽分子的證據和線索。

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